CORONAVÍRUS
Coronavírus
US10130701B2
Estados Unidos
- Inventor
- Erica Bickerton
- Sarah Keep
- Paul Britton
- Cessionário Atual
- INSTITUTO PIRBRIGHT
Aplicações em todo o mundo
Aplicativo US15 / 328.179 eventos
23/07/2014
Prioridade para GB1413020.7
23/07/2015
03/08/2017
20/11/2018
20/11/2018
Pedido concedido
2020-01-28
O status do aplicativo é Ativo
2035-07-23
Expiração prevista
Descrição
CAMPO DE INVENÇÃO
Exemplo 3 - Reparo de rIBVs M41-R
A presente invenção refere-se a um coronavírus atenuado compreendendo um gene variante da replicase, que faz com que o vírus tenha patogenicidade reduzida. A presente invenção também se refere ao uso desse coronavírus em uma vacina para prevenir e / ou tratar uma doença.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV), o agente etiológico da bronquite infecciosa (IB), é um patógeno altamente infeccioso e contagioso das aves domésticas que se replica principalmente no trato respiratório, mas também nas células epiteliais do intestino, rim e oviduto. O IBV é membro da Ordem Nidovirales, Família Coronaviridae, Subfamília Corona virinae e Gênero Gammacoronavirus ; coronavírus geneticamente muito semelhantes causam doenças em perus, pintadas e faisões.
Os sinais clínicos de IB incluem espirros, estertores traqueais, corrimento nasal e chiado no peito. As aves do tipo carne reduzem o ganho de peso, enquanto as que põem ovos põem menos ovos e produzem ovos de baixa qualidade. A infecção respiratória predispõe as galinhas a infecções bacterianas secundárias, que podem ser fatais em pintos. O vírus também pode causar danos permanentes ao oviduto, especialmente em pintos, levando à produção e qualidade de ovos reduzidas; e rim, às vezes levando a doença renal que pode ser fatal.
Foi relatado que o IBV é responsável por mais perdas econômicas para a indústria avícola do que qualquer outra doença infecciosa. Embora as vacinas vivas atenuadas e as inativadas sejam universalmente usadas no controle do IBV, a proteção obtida pelo uso da vacinação pode ser perdida devido à quebra da vacina ou à introdução de um novo sorotipo do IBV que não esteja relacionado à vacina utilizada, apresentando risco para a indústria avícola.
Além disso, é necessário que a indústria desenvolva vacinas adequadas para uso in ovo, a fim de melhorar a eficiência e a relação custo-benefício dos programas de vacinação. Um grande desafio associado à vacinação in ovo é que o vírus deve ser capaz de se replicar na presença de anticorpos de origem materna contra o vírus, sem ser patogênico para o embrião. As vacinas atuais contra o IBV são derivadas após passagem múltipla em ovos embrionados, resultando em vírus com patogenicidade reduzida para galinhas, para que possam ser usadas como vacinas vivas atenuadas. No entanto, esses vírus quase sempre mostram uma virulência aumentada para embriões e, portanto, não podem ser usados na vacinação em óvulos, pois causam uma eclodibilidade reduzida. Em alguns casos, é observada uma redução de 70% na eclodibilidade.
A atenuação após a passagem múltipla em ovos embrionados também sofre com outras desvantagens. É um método empírico, pois a atenuação dos vírus é aleatória e varia toda vez que o vírus é transmitido, portanto, a passagem do mesmo vírus por uma série diferente de óvulos para fins de atenuação levará a um conjunto diferente de mutações que levam à atenuação. Também existem problemas de eficácia associados ao processo: algumas mutações afetam a replicação do vírus e algumas das mutações podem tornar o vírus muito atenuado. Também podem ocorrer mutações no gene S, que também podem afetar a imunogenicidade, de modo que a resposta imune desejada seja afetada e a vacina potencial não proteja contra o sorotipo necessário. Além disso, existem problemas associados à reversão à virulência e estabilidade das vacinas.
É importante que vacinas novas e mais seguras sejam desenvolvidas para o controle do IBV. Assim, há uma necessidade de vacinas contra IBV que não estejam associadas a esses problemas, em particular vacinas que podem ser usadas para vacinação in ovo.
RESUMO DOS ASPECTOS DA INVENÇÃO
Os presentes inventores usaram uma abordagem genética reversa para atenuar racionalmente o IBV. Essa abordagem é muito mais controlável do que a atenuação aleatória após várias passagens em ovos embrionados porque a posição de cada mutação é conhecida e seu efeito no vírus, ou seja, o motivo da atenuação, pode ser derivado.
Utilizando a sua abordagem genética reversa, os presentes inventores identificaram várias mutações que fazem com que o vírus tenha níveis reduzidos de patogenicidade. Os níveis de patogenicidade podem ser reduzidos de modo que, quando o vírus é administrado a um óvulo embrionado, ele é capaz de se replicar sem ser patogênico para o embrião. Tais vírus podem ser adequados para a vacinação in ovo, o que é uma vantagem significativa e tem melhora em relação às vacinas contra IBV atenuadas produzidas após múltiplas passagens em ovos embrionados.
Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um coronavírus vivo atenuado compreendendo um gene de replicase variante que codifica poliproteínas que compreende uma mutação em uma ou mais proteínas não estruturais (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 ou nsp-16.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas na lista de:
- Pro para Leu na posição 85 da SEQ ID NO: 6,
- Val para Leu na posição 393 da SEQ ID NO: 7;
- Leu para lie na posição 183 da SEQ ID NO: 8;
- Val a Ile na posição 209 da SEQ ID NO: 9.
O gene da replicase pode codificar uma proteína compreendendo a mutação de aminoácido Pro a Leu na posição 85 da SEQ ID NO: 6.
O gene da replicase pode codificar uma proteína compreendendo as mutações de aminoácidos Val a Leu na posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para lie na posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val para Ile na posição 209 da SEQ ID NO: 9.
O gene da replicase pode codificar uma proteína compreendendo as mutações de aminoácidos Pro a Leu na posição 85 da SEQ ID NO: 6; Val para Leu na posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para lie na posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val para Ile na posição 209 da SEQ ID NO: 9.
O gene da replicase pode compreender uma ou mais substituições nucleotídicas selecionadas da lista de:
C a T na posição de nucleotídeo 12137;
G a C na posição nucleotídica 18114;
T a A na posição nucleotídica 19047; e
G a A na posição nucleotídica 20139;
comparado com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1.
O coronavírus pode ser um vírus da bronquite infecciosa (IBV).
O coronavírus pode ser IBV M41.
O coronavírus pode compreender uma proteína S pelo menos parte da qual é de um sorotipo de IBV diferente de M41.
Por exemplo, a subunidade S1 ou a proteína S inteira podem ser de um sorotipo de IBV diferente de M41.
O coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção reduziu a patogenicidade em comparação com um coronavírus que expressa uma replicase de tipo selvagem correspondente, de modo que quando o vírus é administrado a um ovo embrionado, ele é capaz de se replicar sem ser patogênico para o embrião.
Num segundo aspecto, a presente invenção fornece um gene da replicase variante conforme definido em conexão com o primeiro aspecto da invenção.
Num terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína codificada por um gene variante da replicase de coronavírus de acordo com o segundo aspecto da invenção.
Num quarto aspecto, a presente invenção fornece um plasmídeo compreendendo um gene de replicase de acordo com o segundo aspecto da invenção.
Num quinto aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir o coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção, que compreende as seguintes etapas:
- (i) transfectar um plasmídeo de acordo com o quarto aspecto da invenção em uma célula hospedeira;
- (ii) infectar a célula hospedeira com um vírus recombinante compreendendo o genoma de uma cepa de coronavírus com um gene de replicase;
- (iii) permitir que ocorra recombinação homóloga entre as sequências do gene da replicase no plasmídeo e as sequências correspondentes no genoma do vírus recombinante para produzir um gene da replicase modificado; e
- (iv) seleção de vírus recombinantes compreendendo o gene da replicase modificado.
O vírus recombinante pode ser um vírus vaccinia.
O método também pode incluir a etapa:
- (v) recuperação de coronavírus recombinante compreendendo o gene da replicase modificada do DNA do vírus recombinante da etapa (iv).
Num sexto aspecto, a presente invenção fornece uma célula capaz de produzir um coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma vacina compreendendo um coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar e / ou prevenir uma doença em um sujeito que compreende a etapa de administrar uma vacina de acordo com o sétimo aspecto da invenção ao sujeito.
Outros aspectos da invenção fornecem:
- a vacina de acordo com o sétimo aspecto da invenção para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença em um sujeito.
- uso de um coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção na fabricação de uma vacina para tratamento e / ou prevenção de uma doença em um sujeito.
A doença pode ser bronquite infecciosa (IB).
O método de administração da vacina pode ser selecionado do grupo que consiste em; administração de colírio, administração intranasal, administração de água potável, injeção pós-eclosão e injeção in ovo.
A vacinação pode ser feita através da vacinação em óvulos.
A presente invenção também fornece um método para produzir uma vacina de acordo com o sétimo aspecto da invenção, que compreende a etapa de infectar uma célula de acordo com o sexto aspecto da invenção com um coronavírus de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
FIG. 1- Cinética de crescimento de M41-R-6 e M41-R-12 em comparação com M41-CK (M41 EP4) em células CK
FIG. 2— Sinais clínicos, snicking e chiado no peito, associados a M41-R-6 e M41-R-12 em comparação com M41-CK (M41 EP4) e Beau-R (as barras mostram mock, Beau-R, M41-R 6, M41- R 12, M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
FIG. 3- Atividade ciliar dos vírus nos anéis traqueais isolados de traquéias retiradas de pintos infectados. 100% de atividade ciliar indica nenhum efeito do vírus; apatogênico, 0% de atividade indica perda completa da atividade ciliar, ciliostose completa, indicando que o vírus é patogênico (as barras mostram zombaria, Beau-R, M41-R 6, M41-R 12, M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo )
FIG. 4— Sinais clínicos, snicking, associados a M41R-nsp10rep e M41R-nsp14,15,16rep em comparação com M41-R-12 e M41-CK (M41 EP5) (as barras mostram simulação, M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14 , 15,16rep e M41-CK EP5 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
FIG. 5- Atividade ciliar de M41R-nsp10rep e M41R-nsp14,15,16rep em comparação com M41-R-12 e M41-CK em anéis traqueais isolados de traquéias retiradas de pintos infectados (as barras mostram zombaria; M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R -nsp14,15,16rep e M41-CK EP5 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
FIG. 6— Sinais clínicos, snicking, associados a M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep e M41-K em comparação com M41-CK (as barras mostram mock , M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 e M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
FIG. 7— Sinais clínicos, chiado, associados a M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep e M41-K em comparação com M41-CK (as barras mostram mock , M41R-nsp10,15rep1; M14R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 e M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
FIG. 8- Atividade ciliar de M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep e M41-K em comparação com M41-CK em anéis traqueais isolados de traquéias retiradas de filhotes infectados (As barras mostram mock, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 e M41-CK EP4 da esquerda para a direita da cada ponto no tempo).
FIG. 9- Cinética de crescimento de rIBVs em comparação com M41-CK em células CK. FIG. 9A mostra os resultados para M41-R e M41-K. FIG. 9Bmostra os resultados para M41-nsp10 rep; M41R-nsp14, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 15 rep; M41R-nsp10, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 14, 15 rep; e M41R-nsp10, 14, 16.
FIG. 10- Posição das mutações de aminoácidos nas sequências nsp10, nsp14, nsp15 e nsp16 mutadas.
FIG. 11- A) Snicking; B) Sintomas respiratórios (chiado e estertores combinados) e C) Atividade ciliar de rIBV M41R-nsp 10,14 rep e rIBV M41R-nsp 10,16 rep em comparação com M41-CK (as barras mostram farsa, M41R-nsp10,14rep; M41R -nsp10,16rep e M41-K da esquerda para a direita de cada ponto no tempo).
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção fornece um coronavírus compreendendo um gene variante da replicase que, quando expresso no coronavírus, faz com que o vírus tenha patogenicidade reduzida em comparação com um coronavírus correspondente que compreende o gene da replicase do tipo selvagem.
Coronavírus
Gammacoronavírus é um gênero de vírus animal pertencente à família Coronaviridae. Os coronavírus são vírus envelopados com um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo e uma simetria helicoidal.
O tamanho genômico dos coronavírus varia de aproximadamente 27 a 32 kilobases, que é o tamanho mais longo para qualquer vírus de RNA conhecido.
Os coronavírus infectam principalmente o trato respiratório ou gastrointestinal superior de mamíferos e aves. Cinco a seis diferentes cepas conhecidas atualmente de coronavírus infectam seres humanos. O coronavírus humano mais divulgado, o SARS-CoV, que causa a síndrome respiratória aguda grave (SARS), tem uma patogênese única porque causa infecções do trato respiratório superior e inferior e também pode causar gastroenterite. O coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) também causa uma infecção do trato respiratório inferior em humanos. Acredita-se que os coronavírus causem uma porcentagem significativa de todos os resfriados comuns em adultos humanos.
Os coronavírus também causam uma série de doenças em animais de criação e animais domésticos, algumas das quais podem ser graves e são uma ameaça para a indústria agrícola. Os coronavírus economicamente significativos de animais de criação incluem o vírus da bronquite infecciosa (IBV), que causa principalmente doenças respiratórias em galinhas e afeta seriamente a indústria avícola em todo o mundo; coronavírus porcino (gastroenterite transmissível, TGE) e coronavírus bovino, que resultam em diarréia em animais jovens. O coronavírus felino tem duas formas, o coronavírus entérico felino é um patógeno de menor significado clínico, mas a mutação espontânea desse vírus pode resultar em peritonite infecciosa felina (FIP), uma doença associada à alta mortalidade.
Existem também dois tipos de coronavírus canino (CCoV), um que causa doença gastrointestinal leve e outro que causa doença respiratória. O vírus da hepatite de camundongo (MHV) é um coronavírus que causa uma doença epidêmica de murino com alta mortalidade, especialmente entre colônias de camundongos de laboratório.
Os coronavírus são divididos em quatro grupos, como mostrado abaixo:
- Alfa
- Coronavírus canino (CCoV)
- Coronavírus felino (FeCoV)
- Coronavírus humano 229E (HCoV-229E)
- Vírus da diarréia epidêmica porcina (PEDV)
- Vírus da gastroenterite transmissível (TGEV)
- Coronavírus Humano NL63 (NL ou New Haven)
- Beta
- Coronavírus bovino (BCoV)
- Coronavírus respiratório canino (CRCoV) - comum no Sudeste Asiático e Micronésia
- Coronavírus humano OC43 (HCoV-OC43)
- Vírus da hepatite de camundongo (MHV)
- Vírus da encefalomielite hemaglutinante suína (HEV)
- Coronavírus de rato (Roy). O coronavírus de rato é bastante prevalente no leste da Austrália, onde, em março / abril de 2008, foi encontrado entre colônias de roedores nativos e selvagens.
- (Nenhum nome comum até o momento) (HCoV-HKU1)
- Coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV)
- Coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV)
- Gama
- Vírus da bronquite infecciosa (IBV)
- Coronavírus da Turquia (vírus da doença Bluecomb)
- Coronavírus de faisão
- Coronavírus de aves da Guiné
- Delta
- Coronavírus de bulbo (BuCoV)
- Tordo-coronavírus (ThCoV)
- Coronavírus de Munia (MuCoV)
- Coronavírus suíno (PorCov) HKU15
- Alfa
O gene variante da replicase do coronavírus da presente invenção pode ser derivado de um alfa-coronavírus como o TGEV; um betacoronavírus tal como MHV; ou um gammacoronavírus como o IBV.
Como aqui utilizado, o termo "derivado de" significa que o gene da replicase compreende substancialmente a mesma sequência nucleotídica que o gene da replicase do tipo selvagem do coronavírus relevante. Por exemplo, o gene da replicase variante da presente invenção pode ter até 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a sequência da replicase do tipo selvagem. O gene variante da replicase de coronavírus codifica uma proteína que compreende uma mutação em uma ou mais proteínas não estruturais (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 ou nsp-16 quando comparada à sequência do tipo selvagem da não-estrutural proteína.
IBV
A bronquite infecciosa aviária (IB) é uma doença respiratória aguda e altamente contagiosa de galinhas, que causa perdas econômicas significativas. A doença é caracterizada por sinais respiratórios, incluindo respiração ofegante, tosse, espirros, estertores traqueais e secreção nasal. Em galinhas jovens, podem ocorrer distúrbios respiratórios graves. Em camadas, desconforto respiratório, nefrite, diminuição da produção de ovos e perda da qualidade interna e da qualidade da casca do ovo são comuns.
Em frangos de corte, tosse e chocalho são sinais clínicos comuns, espalhando-se rapidamente em todas as aves do local. A morbidade é de 100% em bandos não vacinados. A mortalidade varia dependendo da idade, cepa do vírus e infecções secundárias, mas pode chegar a 60% em bandos não vacinados.
O primeiro sorotipo de IBV a ser identificado foi Massachusetts, mas nos Estados Unidos estão circulando atualmente vários sorotipos, incluindo Arkansas e Delaware, além do tipo originalmente identificado de Massachusetts.
A estirpe IBV Beaudette foi derivada após pelo menos 150 passagens em embriões de galinha. O IBV Beaudette não é mais patogênico para galinhas chocadas, mas mata rapidamente embriões.
H120 é uma cepa de vacina comercial sorotipo atenuado ao vivo do IBV Massachusetts, atenuada por aproximadamente 120 passagens em ovos de galinha embrionados. O H52 é outra vacina de Massachusetts e representa um vírus de passagem anterior e um pouco mais patogênico (passagem 52) durante o desenvolvimento do H120. Vacinas baseadas no H120 são comumente usadas.
IB QX é um isolado de campo virulento do IBV. Às vezes, é conhecido como "QX chinês", pois foi originalmente isolado após surtos de doenças na região de Qingdao, na China, em meados dos anos 90. Desde então, o vírus se arrastou para a Europa. Desde 2004, problemas graves na produção de ovos foram identificados com um vírus muito semelhante em partes da Europa Ocidental, predominantemente na Holanda, mas também relatados na Alemanha, França, Bélgica, Dinamarca e Reino Unido.
O vírus isolado dos casos holandeses foi identificado pelo Instituto de Pesquisa Holandês de Deventer como uma nova cepa que eles chamaram de D388. A conexão chinesa veio de outros testes que mostraram que o vírus era 99% semelhante ao vírus chinês QX. Uma cepa de vacina IBV viva atenuada semelhante a QX foi agora desenvolvida.
O IBV é um vírus envelopado que se replica no citoplasma celular e contém um genoma de RNA de sentido positivo, não segmentado, de fita simples. O IBV possui um genoma de RNA de 27,6 kb e, como todos os coronavírus, contém as quatro proteínas estruturais; glicoproteína de pico (S), proteína de membrana pequena (E), proteína de membrana integral (M) e proteína de nucleocapsídeo (N) que interage com o RNA genômico.
O genoma é organizado da seguinte maneira: 5 'UTR - gene da polimerase (replicase) - genes de proteínas estruturais (SEMN) - UTR 3'; onde os UTR são regiões não traduzidas (cada ≤500 nucleotídeos no IBV).
O envelope lipídico contém três proteínas da membrana: S, M e E. A proteína S do IBV é uma glicoproteína do tipo I que oligomeriza no retículo endoplasmático e é montada no homotrímero inserido na membrana do virião via domínio transmembranar e está associado a não-covalente interações com a proteína M. Após a incorporação nas partículas do coronavírus, a proteína S é responsável pela ligação ao receptor da célula alvo e pela fusão das membranas virais e celulares. A glicoproteína S consiste em quatro domínios: uma sequência de sinal que é clivada durante a síntese; o ectodomínio, que está presente no exterior da partícula do virião; a região transmembranar responsável por ancorar a proteína S na bicamada lipídica da partícula do virião; e a cauda citoplasmática.
Todos os coronavírus também codificam um conjunto de genes proteicos acessórios de função desconhecida que não são necessários para replicação in vitro, mas podem desempenhar um papel na patogênese. O IBV codifica dois genes acessórios, genes 3 e 5, que expressam duas proteínas acessórios 3a, 3b e 5a, 5b, respectivamente.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode ser derivado de um IBV. Por exemplo, o IBV pode ser IBV Beaudette, H120, H52, IB QX, D388 ou M41.
O IBV pode ser IBV M41. M41 é um sorotipo prototípico de Massachusetts que foi isolado nos EUA em 1941. É um isolado usado em muitos laboratórios em todo o mundo como uma mancha patogênica em laboratório e pode ser obtido na ATCC (VR-21 ™). Variantes atenuadas também são usadas por vários produtores de vacinas como vacinas IBV contra sorotipos de Massachusetts, causando problemas no campo. Os presentes inventores optaram por usar esta cepa, pois haviam trabalhado por muitos anos nesse vírus e porque a sequência do genoma completo do vírus está disponível. O isolado M41, M41-CK, utilizado pelos presentes inventores foi adaptado para crescer em células primárias de rim de pintinho (CK) e, portanto, foi considerado passível de recuperação como um vírus infeccioso a partir de um cDNA do genoma completo.
A sequência do genoma do IBV M41-CK é fornecida como SEQ ID NO: 1.
Sequência IBV M41-CK SEQ ID NO: 1 ACTTAAGATAGATATTAATATATATCTATCACACTAGCCTTGCGCTAGATTTCCAACTTA ACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCCTCATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTTT AGTGCCCTGGATGGCACCTGGCCACCTGTCAGGTTTTTGTTATTAAAATCTTATTGTTGC TGGTATCACTGCTTGTTTTGCCGTGTCTCACTTTATACATCCGTTGCTTGGGCTACCTAG TATCCAGCGTCCTACGGGCGCCGTGGCTGGTTCGAGTGCGAAGAACCTCTGGTTCATCTA GCGGTAGGCGGGTGTGTGGAAGTAGCACTTCAGACGTACCGGTTCTGTTGTGTGAAATAC GGGGTCACCTCCCCCCACATACCTCTAAGGGCTTTTGAGCCTAGCGTTGGGCTACGTTCT CGCATAAGGTCGGCTATACGACGTTTGTAGGGGGTAGTGCCAAACAACCCCTGAGGTGAC AGGTTCTGGTGGTGTTTAGTGAGCAGACATACAATAGACAGTGACAACATGGCTTCAAGC CTAAAACAGGGAGTATCTGCGAAACTAAGGGATGTCATTGTTGTATCCAAAGAGATTGCT GAACAACTTTGTGACGCTTTGTTTTTCTATACGTCACACAACCCTAAGGATTACGCTGAT GCTTTTGCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGCAGACTGGGAAACAGTTCAAATTT GAAACTGTGTGTGGTCTCTTCCTCTTGAAGGGAGTTGACAAAATAACACCTGGCGTCCCA GCAAAAGTCTTAAAAGCCACTTCTAAGTTGGCAGATTTAGAAGACATCTTTGGTGTCTCT CCCTTTGCAAGAAAATATCGTGAACTTTGAAGACAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTGTA 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AGAGTGTCACAACAGCGTGAGTTAGCTACTCAGAAAATTAATGAGTGTGTTAAGTCACAG TCTATTAGGTACTCCTTTTGTGGTAATGGACGACATGTTCTAACCATACCGCAAAATGCA CCTAATGGTATAGTGTTTATACACTTTTCTTATACTCCAGATAGTTTTGTTAATGTTACT GCAATAGTGGGTTTTTGTGTAAAGCCAGCTAATGCTAGTCAGTATGCAATAGTACCCGCT AATGGTAGGGGTATTTTTATACAAGTTAATGGTAGTTACTACATCACAGCACGAGATATG TATATGCCAAGAGCTATTACTGCAGGAGATATAGTTACGCTTACTTCTTGTCAAGCAAAT TATGTAAGTGTAAATAAGACCGTCATTACTACATTCGTAGACAATGATGATTTTGATTTT AATGACGAATTGTCAAAATGGTGGAATGACACTAAGCATGAGCTACCAGACTTTGACAAA TTCAATTACACAGTACCTATACTTGACATTGATAGTGAAATTGATCGTATTCAAGGCGTT ATACAGGGTCTTAATGACTCTTTAATAGACCTTGAAAAACTTTCAATACTCAAAACTTAT ATTAAGTGGCCTTGGTATGTGTGGTTAGCCATAGCTTTTGCCACTATTATCTTCATCTTA ATACTAGGATGGGTTTTCTTCATGACTGGATGTTGTGGTTGTTGTTGTGGATGCTTTGGC ATTATGCCTCTAATGAGTAAGTGTGGTAAGAAATCTTCTTATTACACGACTTTTGATAAC GATGTGGTAACTTAACAATACAGACCTAAAAAGTCTGTTTAATGATTCAAAGTCCCACGT CCTTCCTAATAGTATTAATTTTTCTTTGGTGTAAACTTGTACTAAGTTGTTTTAGAGAGT TTATTATAGCGCTCCAACAACTAATACAAGTTTTACTCCAAATTATCAATAGTAACTTAC AGCCTAGACTGACCCTTTGTCACAGTCTAGACTAATGTTAAACTTAGAAGCAATTATTGA AACTGGTGAGCAAGTGATTCAAAAAATCAGTTTCAATTTACAGCATATTTCAAGTGTATT AAACACAGAAGTATTTGACCCCTTTGACTATTGTTATTACAGAGGAGGTAATTTTTGGGA AATAGAGTCAGCTGAAGATTGTTCAGGTGATGATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGG AAAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTATATATTTGTAGGATTTTTAGCACTTTATCTTC TAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATA CATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATATAAGTATACATATGGTA GAAAACTTAACAATCGGGAATTAGAAGCAGTTATTGTCAACGAGTTTCCTAAGAACGGTT GGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGAC TTTGAACAGTCAGTTGAGCTTTTTAAAGAGTATAATTTATTTATAACTGCATTCTTGTTG TTCTTAACCATAATACTTCAGTATGGCTATGCAACAAGAAGTAAGTTTATTTATATACTG AAAATGATAGTGTTATGGTGCTTTTGGCCCCTTAACATTGCAGTAGGTGTAATTTCATGT ATATACCCACCAAACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACAGTGTTTGCGTGT CTGTCTTTTGTAGGTTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGTGTAGGTCATGG TGGTCATTTAACCCAGAATCTAATGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAACAA TGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCAATGGTGCTTTCTCCAATTATAAAGAATGGTGTT CTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAGTGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGATATA TTTGTTTGTACACCGGATAGACGTAATATCTACCGTATGGTGCAGAAATATACTGGTGAC CAAAGCGGAAATAAGAAACGGTTTGCTACGTTTGTCTATGCAAAGCAGTCAGTAGATACT GGCGAGCTAGAAAGTGTAGCAACAGGAGGGAGTAGTCTTTACACCTAAATGTGTGTGTGT AGAGAGTATTTAAAATTATTCTTTAATAGTGCCTCTATTTAAGAGCGCATAATAGTATT ATTTTTGAGGATATTAATATAAATCCTCTCTGTTTTATACTCTCTTTTCAAGAGCTATTA TTTAAAAAACAGTTTTTCCACTCTTTTGTGCCAAAAACTATTGTTGTTAATGGTGTAACC TTTCAAGTAGATAATGGAAAAGTCTACTACGAAGGAAAACCAATTTTTCAGAAAGGTTGT TGTAGGTTGTGGTTGAGTTATAAAAAAGATTAAACTACCTACTACACTTATTTTTATAAG AGGCGTTTTATCTTACAAGCGCTTAATAAATACGGACGATGAAATGGCTGACTAGTTTTG TAAGGGCAGTTATTTCATGTTATAAACCCCTATTATTAACTCAATTAAGAGTATTAGATA GGTTAATCTTAGATCATGGACCAAAACACATCTTAACGTGTGTTAGGTGCGTGATTTTGT TTCAATTAGATTTAGTTTATAGGTTGGCGTATACGCCTACTCAATCGCTGGTATGAATAA TAGTAAAGATAATCCTTTTTGCGGAGCAATAGCAAGAAAAGCGCGAATTTATCTGAGAGA AGGATTAGATTGTGTTTACTTTCTTAACAAAGCAGGACAAGCAGAGTCTTGTCCCGCGTG TACCTCTCTAGTATTCCAGGGGAAAACTTGTGAGGAACACAAATATAATAATAATCTTTT GTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGAAAGACAGATGCCCCAGCTCCAGTCATCAAACTA GGAGGACCAAAGCCACCTAAAGTTGGTTCTTCTGGAAATGTATCTTGGTTTCAAGCAATA AAAGCCAAGAAGTTAAATTCACCTCCGCCTAAGTTTGAAGGTAGCGGTGTTCCTGATAAT GAAAATCTAAAACCAAGTCAGCAGCATGGATATTGGAGACGCCAAGCTAGGTTTAAGCCA GGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAGATGCTTGGTATTTTTAGTATACTGGAACAGGA CCAGCCGCTAACCTGAATTGGGGTGATAGCCAAGATGGTATAGTGTGGGTTGCTGGTAAG GGTGCTGATACTAAATTTAGATCTAATCAGGGTACTCGTGACTCTGACAAGTTTGACCAA TATCCGCTACGGTTTTCAGACGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGATTTCATTCCT CTGAATCGTGGCAGGAGTGGGAGATCAACAGCAGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCA CCATCACGTGAAGTTTCGCGTGGTCGCAGGAGTGGTTCTGAAGATGATCTTATTGCTCGT GCAGCAAGGATAATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTCGCATTACAAAGGCTAAGGCT GATGAAATGGCTCACCGCCGGTATTGCAAGCGCAGTATTCCACCTAATTATAAGGTTGAT CAAGTGTTTGGTCCCCGTACTAAAGGTAAGGAGGGAAATTTGGTGATGACAAGATGAAT GAGGAAGGTATTAAGGATGGGCGCGTTACAGCAATGCTCAACCTAGTTCCTAGCAGCCAT GCTTGTCTTTTCGGAAGTAGAGTGACGCCCAGACTTCAACCAGATGGGCTGCACTTGAAA TTTGAATTTACTACTGTGGTCCCACGTGATGATCCGCAGTTTGATAATTATGTAAAAATT TGTGATCAGTGTGTTGATGGTGTAGGAACACGTCCAAAAGATGATGAACCAAGACCAAAG TCACGCTCAAGTTCAAGACCTGCAACAAGAGGAAATTCTCCAGCGCCAAGACAGCAGCGC CCTAAGAAGGAGAAAAAGCCAAAGAAGCAGGATGATGAAGTGGATAAAGCATTGACCTCA GATGAGGAGAGGAACAATGCACAGCTGGAATTTGATGATGAACCCAAGGTAATTAACTGG GGGGATTCAGCGCTAGGAGAGAATGAACTTTGAGTAAAATTGAATAGTAAGAGTTAAGGA AGATAGGCATGTAGCTTGATTACCTACATGTCTATCGCCAGGGAAATGTCTAATTTGTCT ACTTAGTAGCCTGGAAACGAACGGTAGACCCTTAGATTTTAATTTAGTTTAATTTTTAGT TTAGTTTAAGTTAGTTTAGAGTAGGTATAAAGATGCCAGTGGCGGGGCCACGCGGAGTAC GACCGAGGGTACAGCACTAGGACGCCCATTAGGGGAAGAGCTAAATTTTAGTTTAAGTTA AGTTTAATTGGCTATGTATAGTTAAAATTTATAGGCTAGTATAGAGTTAGAGCAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Replicase
Além dos genes estruturais e acessórios, dois terços de um genoma de coronavírus compreendem o gene da replicase (na extremidade 5 'do genoma), que é expresso como duas poliproteínas, pp1a e pp1ab, nas quais pp1ab é um produto de extensão de pp1a como resultado de um mecanismo de deslocamento ribossômico -1. As duas poliproteínas são clivadas por dois tipos de proteinases codificadas por vírus, geralmente resultando em 16 proteínas não estruturais (Nsp1-16); O IBV não possui Nsp1, codificando assim Nsp2-16.
Assim, o gene 1 no IBV codifica 15 (16 em outros coronavírus) proteínas não estruturais (nsp2-16), que estão associadas à replicação e transcrição do RNA.
O termo 'proteína replicase' é aqui utilizado para se referir às poliproteínas pp1a e pp1ab ou subunidades nsp individuais.
O termo 'gene da replicase' é aqui utilizado para se referir a uma sequência de ácido nucleico que codifica para proteínas da replicase.
A summary of the functions of coronavirus nsp proteins is provided in Table 1.
TABLE 1 Nsp Protein Key features 1 Conserved within but not between coronavirus genetic groups; potential regulatory functions in the host cell. 2 Dispensable for MHV and SARS-CoV replication in tissue culture 3 Acidic domain; macro domain with ADRP and poly (ADP-ribose)-binding activities; one or two ZBD- containing papain-like proteases; Y domain 4 Transmembrane domain 5 3C-like main protease, homodimer 6 Transmembrane domain 7 Interacts with nsp8 to form a hexadecamer complex 8 Noncannonical RNA polymerase; interacts with nsp7 to form a hexadecameric complex 9 ssRNA-binding protein, dimer 10 RNA-binding protein, homododecamer, zinc-binding domain, known to interact with nsp14 and nsp16 11 Unknown 12 RNA-dependent RNA polymerase 13 Zinc-binding domain, NTPase, dNTPase, 5′-to-3′ RNA and DNA helicase, RNA 5′-triphosphate 14 3′-to 5′ exoribonuclease, zinc-binding domain and N7- methyltransferase 15 Uridylate-specific endoribonuclease, homohexamer 16 Putative ribose-2′-O-methyltransferase
The variant replicase gene encoded by the coronavirus of the present invention comprises a mutation in one or more of the sections of sequence encoding nsp-10, nsp-14, nsp-15 or nsp-16.
Nsp10 has RNA-binding activity and appears to be involved in homo and/or heterotypic interactions within other nsps from the pp1a/pp1ab region. It adopts an α/β fold comprised of five α-helices, one 310-helix and three β-strands. Two zinc-binding sites have been identified that are formed by conserved cysteine residues and one histidine residue (Cys-74/Cys-77/His-83/Cys-90; Cys-117/Cys-120/Cys-128/Cys-130). The protein has been confirmed to bind single-stranded and double-stranded RNA and DNA without obvious specificity. Nsp-10 can be cross-linked with nsp-9, suggesting the existing of a complex network of protein-protein interactions involving nsp-7, -8, -9 and -10. In addition, nsp-10 is known to interact with nsp-14 and nsp-16.
Nsp-14 comprises a 3′-to-5′ exoribonuclease (ExoN) active domain in the amino-terminal region. SARS-CoV ExoN has been demonstrated to have metal ion-dependent 3′-to-5′ exoribonuclease activity that acts on both single-stranded and double-stranded RNA, but not on DNA. Nsp-14 has been shown to have proof-reading activity. This nsp has also been shown to have N7-methyltransferase (MT) activity in the carboxyl-terminal region.
Nsp-15 associated NendoU (nidoviral endoribonuclease, specific for U) RNase activity has been reported for a number of coronaviruses, including SARS-CoV, MHV and IBV. The activities were consistently reported to be significantly enhanced by Mn2+ ions and there was little activity in the presence of Mg2+ and Ca2+. NendoU cleaves at the 3′ side of uridylate residues in both single-stranded and double-stranded RNA. The biologically relevant substrate(s) of coronavirus NendoUs remains to be identified.
Nsp-16 has been predicted to mediate ribose-2′-O-methyltransferase (2′-O-MTase) activity and reverse-genetics experiments have shown that the 2′-O-MTase domain is essential for viral RNA synthesis in HCoV-229E and SARS-CoV. The enzyme may be involved in the production of the cap 1 structures of coronavirus RNAs and it may also cooperate with NendoU and ExoN in other RNA processing pathways. 2′-O-MTase might also methylate specific RNAs to protect them from NendoU-mediated cleavage.
The genomic and protein sequences for nsp-10, -14, -15 and -16 are provided as SEQ ID NO: 2-5 and 6-9, respectively.
(nsp-10 nucleotide sequence- nucleotides 11884-12318 of SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 2 TCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAGGCATTCTCTCACTTTGTTCTTTTGCAGTA GATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGCAGCAGGTAATCAACCTTTAGGTAACTGTGTTAAA ATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATCAAAGCCAAGTCCAACTCCGGATCAG GATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAGAGCACATATAGCACACCTTGGCGGAGCA GGAAATTTAGATGGACGCTGTCAATTTAAAGGTTCTTTTGTGCAAATACCTACTACGGAGAAAGAT CCTGTTGGATTCTGTCTACGTAACAAGGTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTGGATTGGTTATGGATGT CAGTGTGATTCACTTAGACAACCTAAACCTTCTGTTCAG (nsp-14 nucleotide sequence- nucleotides 16938-18500 of SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 3 GGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTGTTCACCCAGCTTATGCAGTCACA ACTAAGGCTCTTGCTGCAACTTATAAAGTTAATGATGAACTTGCTGCACTTGTTAACGTGGAAGCT GGTTCAGAAATAACATATAAACATCTTATTTCTTTGTTAGGGTTTAAGATGAGTGTTAATGTTGAA GGCTGCCACAACATGTTTATAACACGTGATGAGGCTATCCGCAACGTAAGAGGTTGGGTAGGTTTT GATGTAGAAGCAACACATGCTTGCGGTACTAACATTGGTACTAACCTGCCTTTCCAAGTAGGTTTC TCTACTGGTGCAGACTTTGTAGTTACGCCTGAGGGACTTGTAGATACTTCAATAGGCAATAATTTT GAGCCTGTGAATTCTAAAGCACCTCCAGGTGAACAATTTAATCACTTGAGAGCGTTATTCAAAAGT GCTAAACCTTGGCATGTTGTAAGGCCAAGGATTGTGCAAATGTTAGCGGATAACCTGTGCAACGTT TCAGATTGTGTAGTGTTTGTCACGTGGTGTCATGGCCTAGAACTAACCACTTTGCGCTATTTTGTT AAAATAGGCAAGGACCAAGTTTGTTCTTGCGGTTCTAGAGCAACAACTTTTAATTCTCATACTCAG GCTTATGCTTGTTGGAAGCATTGCTTGGGTTTTGATTTTGTTTATAATCCACTCTTAGTGGATATT CAACAGTGGGGTTATTCTGGTAACCTACAATTTAACCATGATTTGCATTGTAATGTGCATGGACAC GCACATGTAGCTTCTGCGGATGCTATTATGACGCGTTGTCTTGCAATTAATAATGCATTTTGTCAA GATGTCAACTGGGATTTAACTTACCCTCATATAGCAAATGAGGATGAAGTCAATTCTAGCTGTAGA TATTTACAACGCATGTATCTTAATGCATGTGTTGATGCTCTTAAAGTTAACGTTGTCTATGATATA GGCAACCCTAAAGGTATTAAATGTGTTAGACGTGGAGACTTAAATTTTAGATTCTATGATAAGAAT CCAATAGTACCCAATGTCAAGCAGTTTGAGTATGACTATAATCAGCACAAAGATAAGTTTGCTGAT GGTCTTTGTATGTTTTGGAATTGTAATGTGGATTGTTATCCCGACAATTCCTTACTTTGTAGGTAC GACACACGAAATTTGAGTGTGTTTAACCTACCTGGTTGTAATGGTGGTAGCTTGTATGTTAACAAG CATGCATTCCACACACCTAAATTTGATCGCACTAGCTTTCGTAATTTGAAAGCTATGCCATTCTTT TTCTATGACTCATCGCCTTGCGAGACCATTCAATTGGATGGAGTTGCGCAAGACCTTGTGTCATTA GCTACGAAAGATTGTATCACAAAATGCAACATAGGCGGTGCTGTTTGTAAAAAGCACGCACAAATG TATGCAGATTTTGTGACTTCTTATAATGCAGCTGTTACTGCTGGTTTTACTTTTTGGGTTACTAAT AATTTTAACCCATATAATTTGTGGAAAAGTTTTTCAGCTCTCCAG (nsp-15 nucleotide sequence- nucleotides 18501-19514 of SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 4 TCTATCGACAATATTGCTTATAATATGTATAAGGGTGGTCATTATGATGCTATTGCAGGAGAAATG CCCACTATCGTAACTGGAGATAAAGTTTTTGTTATAGATCAAGGCGTAGAAAAAGCAGTTTTTTTT AATCAAACAATTCTGCCTACATCTGTAGCGTTTGAGCTGTATGCGAAGAGAAATATTCGCACACTG CCAAACAACCGTATTTTGAAAGGTTTGGGTGTAGATGTGACTAATGGATTTGTAATTTGGGATTAC ACGAACCAAACACCACTATACCGTAATACTGTTAAGGTATGTGCATATACAGACATAGAACCAAAT GGCCTAATAGTGCTGTATGATGATAGATATGGTGATTACCAGTCTTTTCTAGCTGCTGATAATGCT GTTTTAGTTTCTACACAGTGTTACAAGCGGTATTCGTATGTAGAAATACCGTCAAACCTGCTTGTT CAGAACGGTATTCCGTTAAAAGATGGAGCGAACCTGTATGTTTATAAGCGTGTTAATGGTGCGTTT GTTACGCTACCTAACACAATAAACACACAGGGTCGAAGTTATGAAACTTTTGAACCTCGTAGTGAT GTTGAGCGTGATTTTCTCGACATGTCTGAGGAGAGTTTTGTAGAAAAGTATGGTAAAGAATTAGGT CTACAGCACATACTGTATGGTGAAGTTGATAAGCCCCAATTAGGTGGTTTCCACACTGTTATAGGT ATGTGCAGACTTTTACGTGCGAATAAGTTGAACGCAAAGTCTGTTACTAATTCTGATTCTGATGTC ATGCAAAATTATTTTGTATTGGCAGACAATGGTTCCTACAAGCAAGTGTGTACTGTTGTGGATTTG CTGCTTGATGATTTCTTAGAACTTCTTAGGAACATACTGAAAGAGTATGGTACTAATAAGTCTAAA GTTGTAACAGTGTCAATTGATTACCATAGCATAAATTTTATGACTTGGTTTGAAGATGGCATTATT AAAACATGTTATCCACAGCTTCAA (nsp-16 nucleotide sequence- nucleotides 19515-20423 of SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 5 TCAGCATGGACGTGTGGTTATAATATGCCTGAACTTTATAAAGTTCAGAATTGTGTTATGGAACCT TGCAACATTCCTAATTATGGTGTTGGAATAGCGTTGCCAAGTGGTATTATGATGAATGTGGCAAAG TATACACAACTCTGTCAATACCTTTCGAAAACAACAATGTGTGTACCGCATAATATGCGAGTAATG CATTTTGGAGCTGGAAGTGACAAAGGAGTGGTGCCAGGTAGTACTGTTCTTAAACAATGGCTCCCA GAAGGGACACTCCTTGTCGATAATGATATTGTAGACTATGTGTCTGATGCACATGTTTCTGTGCTT TCAGATTGCAATAAATATAAGACAGAGCACAAGTTTGATCTTGTGATATCTGATATGTATACAGAC AATGATTCAAAAAGAAAGCATGAAGGCGTGATAGCCAATAATGGCAATGATGACGTTTTCATATAT CTCTCAAGTTTTCTTCGTAATAATTTGGCTCTAGGTGGTAGTTTTGCTGTAAAAGTGACAGAGACA AGTTGGCACGAAGTTTTATATGACATTGCACAGGATTGTGCATGGTGGACAATGTTTTGTACAGCA GTGAATGCCTCTTCTTCAGAAGCATTCTTGATTGGTGTTAATTATTTGGGTGCAAGTGAAAAGGTT AAGGTTAGTGGAAAAACGCTGCACGCAAATTATATATTTTGGAGGAATTGTAATTATTTACAAACC TCTGCTTATAGTATATTTGACGTTGCTAAGTTTGATTTGAGATTGAAAGCAACGCCAGTTGTTAAT TTGAAAACTGAACAAAAGACAGACTTAGTCTTTAATTTAATTAAGTGTGGTAAGTTACTGGTAAGA GATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACTATGTAG (nsp-10 amino acid sequence) SEQ ID NO: 6 SKGHETEEVDAVGILSLCSFAVDPADTYCKYVAAGNQPLGNCVKMLTVKNGSGFAITSKPSPTPDQ DSYGGASVCLYCRAHIAHPGGAGNLDGRCQFKGSFVQIPTTEKDPVGFCLRNKVCTVCQCWIGYGC QCDSLRQPKPSVQ (nsp-14 amino acid sequence) SEQ ID NO: 7 GTGLFKICNKEFSGVHPAYAVTTKALAATYKVNDELAALVNVEAGSEITYKHLISLLGFKMSVNVE GCHNMFITRDEAIRNVRGWVGFDVEATHACGTNIGTNLPFQVGFSTGADFVVTPEGLVDTSIGNNF EPVNSKAPPGEQFNHLRALFKSAKPWHVVRPRIVQMLADNLCNVSDCVVFVTWCHGLELTTLRYFV KIGKDQVCSCGSRATTFNSHTQAYACWKHCLGFDFVYNPLLVDIQQWGYSGNLQFNHDLHCNVHGH AHVASADAIMTRCLAINNAFCQDVNWDLTYPHIANEDEVNSSCRYLQRMYLNACVDALKVNVVYDI GNPKGIKCVRRGDLNFRFYDKNPIVPNVKQFEYDYNQHKDKFADGLCMFWNCNVDCYPDNSLVCRY DTRNLSVFNLPGCNGGSLYVNKHAFHTPKFDRTSFRNLKAMPFFFYDSSPCETIQLDGVAQDLVSL ATKDCITKCNICGAVCKKKAQMYADFVTSYNAAVTAGFTFWVTNNFNPYNLWKSFSALQ (nsp-15 amino acid sequence) SEQ ID NO: 8 SIDNIAYNMYKGGHYDAIAGEMPTIVTGDKVFVIDQGVEKAVFFNQTILPTSVAFELYAKRNIRTL PNNRILKGLGVDVTNGFVIWDYTNQTPLYRNTVKVCAYTDIEPNGLIVLYDDRYGDYQSFLAADNA VLVSTQCYKRYSYVEIPSNLLVQNGIPLKDGANLYVYKRVNGAFVTLPNTLNTQGRSYETFEPRSD VERDFLDMSEESFVEKYGKELGLQHILYGEVDKPQLGGLHTVIGMCRLLRANKLNAKSVTNSDSDV MQNYFVLADNGSYKQVCTVVDLLLDDFLELLRNILKEYGTNKSKVVTVSIDYHSINFMTWFEDGII KTCYPQLQ (nsp-16 amino acid sequence) SEQ ID NO: 9 SAWTCGYNMPELYKVQNCVMEPCNIPNYGVGIALPSGIMMNVAKYTQLCQYLSKTTMCVPHNMRVM HFGAGSDKGVAPGSTVLKQWLPEGTLLVDNDIVDYVSDAHVSVLSDCNKYKTEHKFDLVISDMYTD NDSKRKHEGVIANNGNDDVFIYLSSFLRNNLALGGSFAVKVTETSWHEVLYDIAQDCAWWTMFCTA VNASSSEAFLVGVNYLGASEKVIWSGKTLHANYIFWRNCNYLQTSAYSIFDVAKFDLRLKATPVVN LKTEQKTDLVFNLIKCGKLLVRDVGNTSFTSDSFVCTM
Reduced Pathogenicity
The live, attenuated coronavirus of the present invention comprises a variant replicase gene which causes the virus to have reduced pathogenicity compared to a coronavirus expressing the corresponding wild-type gene.
The term “attenuated” as used herein, refers to a virus that exhibits said reduced pathogenicity and may be classified as non-virulent. A live, attenuated virus is a weakened replicating virus still capable of stimulating an immune response and producing immunity but not causing the actual illness.
The term “pathogenicity” is used herein according to its normal meaning to refer to the potential of the virus to cause disease in a subject. Typically the pathogenicity of a coronavirus is determined by assaying disease associated symptoms, for example sneezing, snicking and reduction in tracheal ciliary activity.
The term “reduced pathogenicity” is used to describe that the level of pathogenicity of a coronavirus is decreased, lessened or diminished compared to a corresponding, wild-type coronavirus.
In one embodiment, the coronavirus of the present invention has a reduced pathogenicity compared to the parental M41-CK virus from which it was derived or a control coronavirus. The control coronavirus may be a coronavirus with a known pathogenicity, for example a coronavirus expressing the wild-type replicase protein.
The pathogenicity of a coronavirus may be assessed utilising methods well-known in the art. Typically, pathogenicity is assessed by assaying clinical symptoms in a subject challenged with the virus, for example a chicken.
As an illustration, the chicken may be challenged at 8-24 days old by nasal or ocular inoculation. Clinical symptoms, associated with IBV infection, may be assessed 3-10 days post-infection. Clinical symptoms commonly assessed to determine the pathogenicity of a coronavirus, for example an IBV, include gasping, coughing, sneezing, snicking, depression, ruffled feathers and loss of tracheal ciliary activity.
The variant replicase of the present invention, when expressed in a coronavirus, may cause a reduced level of clinical symptoms compared to a coronavirus expressing a wild-type replicase.
For example a coronavirus expressing the variant replicase may cause a number of snicks per bird per minute which is less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20% or less than 10% of the number of snicks caused by a virus expressing the wild type replicase.
A coronavirus expressing a variant replicase according to the present invention may cause wheezing in less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20% or less than 10% of the number of birds in a flock infected with the a virus expressing the wild type replicase.
A coronavirus expressing a variant replicase according to the present invention may result in tracheal ciliary activity which is at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the level of tracheal ciliary activity in uninfected birds.
A coronavirus expressing a variant replicase according to the present invention may cause clinical symptoms, as defined in Table 2, at a lower level than a coronavirus expressing the wild type replicase.
TABLE 2 IBV severity limits based on clinical signs:
The variant replicase of the present invention, when expressed in a coronavirus, may cause the virus to replicate at non-pathogenic levels in ovo.
While developing vaccines to be administered in ovo to chicken embryos, attention must be paid to two points: the effect of maternal antibodies on the vaccines and the effect of the vaccines on the embryo. Maternal antibodies are known to interfere with active immunization. For example, vaccines with mild strains do not induce protective antibody levels when administered to broiler chickens with maternal antibodies as these strains are neutralized by the maternal antibody pool.
Thus a viral particle must be sufficiently efficient at replicating and propagating to ensure that it is not neutralized by the maternally-derived antibodies against the virus. Maternally-derived antibodies are a finite pool of effective antibodies, which decrease as the chicken ages, and neutralization of the virus in this manner does not equate to the establishment of long-term immunity for the embryo/chick. In order to develop long-term immunity against the virus, the embryo and hatched chicken must develop an appropriate protective immune response which is distinct to the effect of the maternally-derived antibodies.
To be useful for in ovo vaccination, the virus must also not replicate and propagate at a level which causes it to be pathogenic to the embryo.
Reduced pathogenicity in terms of the embryo may mean that the coronavirus causes less reduction in hatchability compared to a corresponding, wild-type control coronavirus. Thus the term “without being pathogenic to the embryo” in the context of the present invention may mean “without causing reduced hatchability” when compared to a control coronavirus.
A suitable variant replicase may be identified using methods which are known in the art. For example comparative challenge experiments following in ovo vaccination of embryos with or without maternally-derived antibodies may be performed (i.e. wherein the layer has or has not been vaccinated against IBV).
If the variant replicase enables the virus to propagate at a level which is too high, the embryo will not hatch or will not be viable following hatching (i.e. the virus is pathogenic to the embryo). A virus which is pathogenic to the embryo may kill the embryo.
If the variant replicase causes a reduction in viral replication and propagation which is too great, the virus will be neutralised by the maternally-derived antibodies. Subsequent challenge of the chick with IBV will therefore result in the development of clinical symptoms (for example wheezing, snicking, loss of ciliary activity) and the onset of disease in the challenged chick; as it will have failed to develop effective immunity against the virus.
Variant
As used herein, the term ‘variant’ is synonymous with ‘mutant’ and refers to a nucleic acid or amino acid sequence which differs in comparison to the corresponding wild-type sequence.
A variant/mutant sequence may arise naturally, or may be created artificially (for example by site-directed mutagenesis). The mutant may have at least 70, 80, 90, 95, 98 or 99% sequence identity with the corresponding portion of the wild type sequence. The mutant may have less than 20, 10, 5, 4, 3, 2 or 1 mutation(s) over the corresponding portion of the wild-type sequence.
The term “wild type” is used to mean a gene or protein having a nucleotide or amino acid sequence which is identical with the native gene or protein respectively (i.e. the viral gene or protein).
Identity comparisons can be conducted by eye, or more usually, with the aid of readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate % identity between two or more sequences. A suitable computer program for carrying out such an alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Examples of other software that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al., 1999 ibid—Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) and the GENEWORKS suite of comparison tools, ClustalX (see Larkin et al. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948). Both BLAST and FASTA are available for offline and online searching (see Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). However, for some applications, it is preferred to use the GCG Bestf it program. A new tool, called BLAST 2 Sequences is also available for comparing protein and nucleotide sequence (see FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
A sequência pode ter uma ou mais deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma molécula funcionalmente equivalente. As substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e / ou natureza anfipática dos resíduos, desde que a atividade seja mantida. Por exemplo, aminoácidos com carga negativa incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.
Substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e de preferência na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos um pelo outro:
ALIFÁTICO Não polar GAP = VÃO I L V Polar- sem carga C S T M N Q Carga polar D E K R AROMÁTICO H F W Y
O coronavírus da presente invenção pode compreender um gene variante da replicase que codifica uma proteína que compreende uma mutação em comparação com qualquer uma das SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9 que, quando expressas em um coronavírus, fazem com que o vírus reduza patogenicidade em comparação com um coronavírus que expressa a replicase de tipo selvagem correspondente.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos em qualquer combinação de nsp-10, nsp-14, nsp-15 e nsp-16.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode codificar uma proteína compreendendo uma mutação conforme definida nas sequências do mod M41 apresentadas em FIG. 10.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode codificar uma proteína que compreende uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas na lista de:
- Pro para Leu na posição 85 da SEQ ID NO: 6,
- Val para Leu na posição 393 da SEQ ID NO: 7;
- Leu para lie na posição 183 da SEQ ID NO: 8;
- Val a Ile na posição 209 da SEQ ID NO: 9.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode codificar uma proteína que não compreende uma mutação nas nsp-2, nsp-3, nsp-6 ou nsp-13.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode codificar uma proteína que não compreende uma mutação na nsp10 que corresponde à mutação da treonina para isoleucina causada por uma mutação na posição de nucleotídeo 12.008 no gene relatado por Ammayappan et al. (Arch Virol (2009) 154: 495-499).
Ammayappan et al. (Como acima) relatam a identificação de alterações na sequência responsáveis pela atenuação da estirpe IBV Arkansas DPI. O estudo identificou 17 alterações de aminoácidos em uma variedade de proteínas IBV após várias passagens, aprox. 100, do vírus em ovos embrionados. Não foi investigado se o vírus atenuado (Ark DPI 101) é capaz de se replicar na presença de anticorpos de origem materna contra o vírus in ovo, sem ser patogênico para o embrião. Dado que esse vírus foi produzido por passagem múltipla em ovos embrionados por FPS, metodologia semelhante para vacinas clássicas contra IBV, é provável que esse vírus seja patogênico para embriões. O vírus também pode ser sensível a anticorpos de origem materna se as galinhas foram vacinadas com um sorotipo semelhante.
O gene da replicase variante do coronavírus da presente invenção pode codificar uma proteína que compreende qualquer combinação de uma ou mais mutações de aminoácidos fornecidas na lista acima.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende a mutação de aminoácido Pro a Leu na posição 85 da SEQ ID NO: 6.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende a mutação de aminoácido Val to Leu na posição 393 da SEQ ID NO: 7.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende a mutação de aminoácido Leu para Ile na posição 183 da SEQ ID NO: 8.
O gene da replicase variante pode codificar uma proteína que compreende a mutação de aminoácido Val a Ile na posição 209 da SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6, and Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6 Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7 and Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6, Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7 and Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6 Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6, Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7, Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may encode a protein which comprises the amino acid mutations Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6, Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7, Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8 and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO: 9.
The variant replicase gene may also be defined at the nucleotide level.
For example the nucleotide sequence of the variant replicase gene of the coronavirus of the present invention may comprise one or more nucleotide substitutions within the regions selected from the list of: 11884-12318, 16938-18500, 18501-19514 and 19515-20423 of SEQ ID NO:1.
For example the nucleotide sequence of the variant replicase gene of the coronavirus of the present invention may comprise one or more nucleotide substitutions selected from the list of:
- C to Tat nucleotide position 12137;
- G to C at nucleotide position 18114;
- T to A at nucleotide position 19047; and
- G to A at nucleotide position 20139;
compared to the sequence shown as SEQ ID NO: 1.
As used herein, the term “substitution” is synonymous with the term mutation and means that the nucleotide at the identified position differs to that of the wild-type nucleotide sequence.
The nucleotide sequence may comprise any combination of the nucleotide substitutions selected from the list of:
- C to Tat nucleotide position 12137;
- G to Cat nucleotide position 18114;
- T to A at nucleotide position 19047; and
- G to A at nucleotide position 20139;
compared to the sequence shown as SEQ ID NO: 1.
The nucleotide sequence may comprise the substitution C12137T.
The nucleotide sequence may comprise substitution G18114C.
The nucleotide sequence may comprise the substitution T19047A.
The nucleotide sequence may comprise the substitution G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T and G18114C.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T and T19047A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions G18114C and T19047A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions G18114C and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions T19047A and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T, G18114C and T19047A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T, T19047A and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T, G18114C and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions G18114C, T19047A and G20139A.
The nucleotide sequence may comprise the substitutions C12137T, G18114C, T19047A and G20139A.
The nucleotide sequence may not comprise a substitution which corresponds to the C12008T substitution reported by Ammayappan et al. (as above).
The nucleotide sequence may be natural, synthetic or recombinant. It may be double or single stranded, it may be DNA or RNA or combinations thereof. It may, for example, be cDNA, PCR product, genomic sequence or mRNA.
The nucleotide sequence may be codon optimised for production in the host/host cell of choice.
It may be isolated, or as part of a plasmid, virus or host cell.
Plasmid
A plasmid is an extra-chromosomal DNA molecule separate from the chromosomal DNA which is capable of replicating independently of the chromosomal DNA. They are usually circular and double-stranded.
Plasmids, or vectors (as they are sometimes known), may be used to express a protein in a host cell. For example a bacterial host cell may be transfected with a plasmid capable of encoding a particular protein, in order to express that protein. The term also includes yeast artificial chromosomes and bacterial artificial chromosomes which are capable of accommodating longer portions of DNA.
The plasmid of the present invention comprises a nucleotide sequence capable of encoding a defined region of the replicase protein. It may also comprise one or more additional coronavirus nucleotide sequence(s), or nucleotide sequence(s) capable of encoding one or more other coronavirus proteins such as the S gene and/or gene 3.
The plasmid may also comprise a resistance marker, such as the guanine xanthine phosphoribosyltransferase gene (gpt) from Escherichia coli, which confers resistance to mycophenolic acid (MPA) in the presence of xanthine and hypoxanthine and is controlled by the vaccinia virus P7.5 early/late promoter.
Recombinant Vaccinia Virus
The present invention also relates to a recombinant vaccinia virus (rVV) comprising a variant replicase gene as defined herein.
The recombinant vaccinia virus (rVV) may be made using a vaccinia-virus based reverse genetics system.
In this respect, the present invention also provides a method for making a viral particle by:
- (i) transfecting a plasmid as described in the previous section into a host cell;
- (ii) infecting the host cell with a recombining virus comprising the genome of a coronavirus strain with a replicase gene;
- (iii) allowing homologous recombination to occur between the replicase gene sequences in the plasmid and the corresponding sequences in the recombining virus genome to produce a modified replicase gene;
- (iv) selecting for recombining virus comprising the modified replicase gene.
The term ‘modified replicase gene’ refers to a replicase gene which comprises a variant replicase gene as described in connection with the first aspect of the present invention. Specifically, the term refers to a gene which is derived from a wild-type replicase gene but comprises a nucleotide sequence which causes it to encode a variant replicase protein as defined herein.
The recombination may involve all or part of the replicase gene. For example the recombination may involve a nucleotide sequence encoding for any combination of nsp-10, nsp-14, nsp-15 and/or nsp-16. The recombination may involve a nucleotide sequence which encodes for an amino acid mutation or comprises a nucleotide substitution as defined above.
The genome of the coronavirus strain may lack the part of the replicase protein corresponding to the part provided by the plasmid, so that a modified protein is formed through insertion of the nucleotide sequence provided by the plasmid.
The recombining virus is one suitable to allow homologous recombination between its genome and the plasmid. The vaccinia virus is particularly suitable as homologous recombination is routinely used to insert and delete sequences for the vaccinia virus genome.
The above method optionally includes the step:
- (v) recovery of recombinant coronavirus comprising the modified replicase gene from the DNA from the recombining virus from step (iv).
Methods for recovering recombinant coronavirus, such as recombinant IBV, are known in the art (See Britton et al (2005) see page 24; and PCT/GB2010/001293).
For example, the DNA from the recombining virus from step (iv) may be inserted into a plasmid and used to transfect cells which express cytoplasmic T7 RNA polymerase. The cells may, for example be pre-infected with a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. Recombinant coronavirus may then be isolated, for example, from the growth medium.
Quando o plasmídeo é inserido no genoma do vírus vaccinia, um intermediário instável é formado. As recombinantes compreendendo o plasmídeo podem ser selecionadas para, por exemplo, o uso de um marcador de resistência no plasmídeo.
Os recombinantes positivos podem então ser verificados para conter o gene da replicase modificado por, por exemplo, PCR e sequenciamento.
Grandes estoques do vírus recombinante, incluindo o gene da replicase modificado (por exemplo, vírus vaccinia recombinante, (rVV), podem ser crescidos e o DNA extraído para realizar a etapa (v)).
Sistemas de genética reversa adequados são conhecidos na arte (Casais et al. (2001) J. Virol 75: 12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77: 9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123: 203-211; Armesto et al. (2008) Methods in Molecular Biology 454: 255-273).
Célula
O coronavírus pode ser usado para infectar uma célula.
As partículas de coronavírus podem ser colhidas, por exemplo, do sobrenadante, por métodos conhecidos na técnica, e opcionalmente purificadas.
A célula pode ser usada para produzir a partícula de coronavírus.
Assim, a presente invenção também fornece um método para a produção de um coronavírus que compreende as seguintes etapas:
(i) infecção de uma célula com um coronavírus de acordo com a invenção;
(ii) permitir que o vírus se replique na célula; e
(iii) colheita do vírus da progênie.
A presente invenção também fornece uma célula capaz de produzir um coronavírus de acordo com a invenção usando um sistema de genética reversa. Por exemplo, a célula pode compreender um genoma de vírus recombinante compreendendo uma sequência nucleotídica capaz de codificar o gene da replicase da presente invenção.
A célula pode ser capaz de produzir vírus recombinantes recombinantes (por exemplo, vírus vaccinia) contendo o gene da replicase.
Alternativamente, a célula pode ser capaz de produzir coronavírus recombinante por um sistema de genética reversa. A célula pode expressar ou ser induzida a expressar a polimerase T7, a fim de resgatar a partícula viral recombinante.
Vacina
O coronavírus pode ser usado para produzir uma vacina. A vacina pode por uma forma viva atenuada do coronavírus da presente invenção e pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui definido, "transportadores farmaceuticamente aceitáveis" adequados para uso na invenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Esses veículos incluem, sem limitação, água, solução salina, solução salina tamponada, tampão fosfato, soluções álcool / aquosas, emulsões ou suspensões. Outros diluentes e excipientes empregues convencionalmente podem ser adicionados de acordo com técnicas convencionais. Tais veículos podem incluir etanol, polióis e suas misturas adequadas, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis. Tampões e agentes de ajuste de pH também podem ser empregados. Os tampões incluem, sem limitação, sais preparados a partir de um ácido ou base orgânicos. Os tampões representativos incluem, sem limitação, sais de ácidos orgânicos, como sais de ácido cítrico, por exemplo, citratos, ácido ascórbico, ácido glucônico, histidina-Hel, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico, Iris, cloridrato de trimetanmina ou tampões de fosfato. Os veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose, trealose, sacarose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os transportadores intravenosos podem incluir reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, como aqueles baseados na dextrose de Ringer e similares. Conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes (por exemplo, EDTA), gases inertes e similares também podem ser fornecidos nos veículos farmacêuticos. A presente invenção não é limitada pela seleção do transportador. A preparação destas composições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, a partir dos componentes descritos acima, possuindo isotonicidade de pH, estabilidade e outras características convencionais apropriadas, está dentro dos conhecimentos da técnica. Veja, por exemplo, textos como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; e The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th ed., eds. RC Rowe et al., APhA Publications, 2003. Lippincott Williams e Wilkins, pub !., 2000; e The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th ed., eds. RC Rowe et al., APhA Publications, 2003. Lippincott Williams e Wilkins, pub !., 2000; e The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th ed., eds. RC Rowe et al., APhA Publications, 2003.
A vacina da invenção será administrada em uma "quantidade terapeuticamente eficaz", que se refere a uma quantidade de um ingrediente ativo, por exemplo, um agente de acordo com a invenção, suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados quando administrado a um sujeito ou paciente. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de acordo com a invenção pode ser facilmente determinada por um versado na técnica. No contexto desta invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é aquela que produz uma mudança objetivamente medida em um ou mais parâmetros associados à condição de Bronquite Infecciosa suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para reduzir a incidência de Bronquite Infecciosa. Como usado aqui, o termo "terapêutico" abrange todo o espectro de tratamentos para uma doença, condição ou distúrbio. Um agente "terapêutico" da invenção pode agir de maneira profilática ou preventiva, incluindo aqueles que incorporam procedimentos projetados para atingir animais que podem ser identificados como estando em risco (farmacogenética); ou de uma maneira que seja de natureza melhorativa ou curativa; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio sendo tratado. Como usado aqui, o termo "terapêutico" abrange todo o espectro de tratamentos para uma doença, condição ou distúrbio. Um agente "terapêutico" da invenção pode agir de maneira profilática ou preventiva, incluindo aqueles que incorporam procedimentos projetados para atingir animais que podem ser identificados como estando em risco (farmacogenética); ou de uma maneira que seja de natureza melhorativa ou curativa; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio sendo tratado. Como usado aqui, o termo "terapêutico" abrange todo o espectro de tratamentos para uma doença, condição ou distúrbio. Um agente "terapêutico" da invenção pode agir de maneira profilática ou preventiva, incluindo aqueles que incorporam procedimentos projetados para atingir animais que podem ser identificados como estando em risco (farmacogenética); ou de uma maneira que seja de natureza melhorativa ou curativa; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio sendo tratado. incluindo aqueles que incorporam procedimentos projetados para atingir animais que podem ser identificados como de risco (farmacogenética); ou de uma maneira que seja de natureza melhorativa ou curativa; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio sendo tratado. incluindo aqueles que incorporam procedimentos projetados para atingir animais que podem ser identificados como de risco (farmacogenética); ou de uma maneira que seja de natureza melhorativa ou curativa; ou pode agir para diminuir a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio sendo tratado.
A presente invenção também se refere a um método para a produção de uma vacina que compreende a etapa de infectar células, por exemplo, células Vero, com uma partícula viral compreendendo uma proteína replicase como definida em conexão com o primeiro aspecto da invenção.
Método de Vacinação
O coronavírus da presente invenção pode ser utilizado para tratar e / ou prevenir uma doença.
"Tratar" significa administrar a vacina a um indivíduo com uma doença existente, a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e / ou desacelerar, reduzir ou bloquear a progressão da doença.
“Prevenir” significa administrar a vacina a um indivíduo que ainda não tenha contraído a doença e / ou que não esteja apresentando nenhum sintoma da doença para prevenir ou prejudicar a causa da doença (por exemplo, infecção) ou reduzir ou impedir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma associado à doença.
A doença pode ser qualquer doença causada por um coronavírus, como uma doença respiratória e / ou gastroenterite em humanos e hepatite, gastroenterite, encefalite ou doença respiratória em outros animais.
A doença pode ser bronquite infecciosa (IB); Diarreia epidêmica porcina; Gastroenterite transmissível; Vírus da hepatite de ratinho; Encefalomielite hemaglutinante suína; Síndrome respiratória aguda grave (SARS); ou doença Bluecomb.
A doença pode ser bronquite infecciosa.
A vacina pode ser administrada a pintos ou galinhas chocados, por exemplo, por colírio ou administração intranasal. Embora precisos, esses métodos podem ser caros, por exemplo, para grandes bandos de frangos. As alternativas incluem inoculação por spray da administração na água potável, mas pode ser difícil garantir uma aplicação uniforme da vacina usando esses métodos.
A vacina pode ser fornecida em uma forma adequada para sua administração, como um conta-gotas para uso intraocular.
A vacina pode ser administrada por inoculação in ovo, por exemplo, por injeção de ovos embrionados. A vacinação in ovo tem a vantagem de fornecer uma resistência inicial à doença. Também facilita a administração de uma dose uniforme por indivíduo, ao contrário da inoculação por spray e administração via água potável.
A vacina pode ser administrada a qualquer compartimento adequado do ovo, incluindo fluido alantóico, saco vitelino, amnion, célula aérea ou embrião. Pode ser administrado abaixo da membrana da casca (célula do ar) e da membrana corioalantóica.
Normalmente, a vacina é injetada em ovos embrionados durante os estágios finais do desenvolvimento embrionário, geralmente durante o último trimestre do período de incubação, como 3-4 dias antes da eclosão. Em galinhas, a vacina pode ser administrada entre os dias 15 e 19 do período de incubação de 21 dias, por exemplo, nos dias 17 ou 18.
O processo pode ser automatizado usando um processo de injeção robótica, como os descritos em WO 2004/078203.
A vacina pode ser administrada juntamente com uma ou mais outras vacinas, por exemplo, vacinas para outras doenças, como o vírus da doença de Newcastle (NDV). A presente invenção também fornece uma composição de vacina compreendendo uma vacina de acordo com a invenção juntamente com uma ou mais outras vacina (s). A presente invenção também fornece um kit que compreende uma vacina de acordo com a invenção juntamente com uma ou mais outras vacinas para administração separada, sequencial ou simultânea.
A vacina ou composição de vacina da invenção pode ser usada para tratar um sujeito humano, animal ou aviário. Por exemplo, o sujeito pode ser um pintinho, galinha ou camundongo (como um camundongo de laboratório, por exemplo, camundongo transgênico).
Normalmente, um médico ou veterinário determinará a dosagem real que será mais adequada para um indivíduo ou grupo de indivíduos e variará com a idade, peso e resposta do (s) indivíduo (s) em particular.
A composição pode opcionalmente compreender um veículo, diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A escolha do veículo farmacêutico, excipiente ou diluente pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como (ou além de) o veículo, excipiente ou diluente, qualquer ligante (s) adequado (s), lubrificante (s), agente (s) de suspensão, agente (s) de revestimento, agente (s) de solubilização e outros agentes transportadores que podem ajudar ou aumentar a entrega ou imunogenicidade do vírus.
A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de Exemplos, que devem servir para auxiliar um versado na técnica na realização da invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOSExemplo 1 - Geração de um sistema de genética reversa IBV baseado em M41-CK
Um cDNA de comprimento total de M41-CK foi produzido por substituição do cDNA de Beaudette no sistema de genética reversa do vírus Vaccinia descrito anteriormente em PCT / GB2010 / 001293 (aqui incorporado por referência) por cDNA sintético derivado da sequência de consenso M41.
O cDNA do IBV na estrutura do vírus Vaccinia recombinante (rVV) rVV-BeauR-Rep-M41 descrito em Armesto, Cavanagh e Britton (2009). PLoS ONE 4 (10): e7384. doi: 10.1371 / journal.pone.0007384, que consistia na replicase derivada da cepa IBV Beaudette e nos genes estruturais e acessórios e 3 'UTR do IBV M41-CK, foi posteriormente modificada pela substituição do Beaudette 5' UTR-Nsp2- Sequência Nsp3 com a sequência correspondente de IBV M41-CK. O cDNA do IBV resultante consistiu em 5 'UTR-Nsp2-Nsp3 de M41, Nsp4-Nsp16 de Beaudette e os genes estruturais e acessórios e 3' UTR de M41. Este cDNA foi ainda modificado pela deleção da sequência Beaudette Nsp4-Nsp16. O cDNA resultante, sem Nsp4-16, foi modificado em quatro etapas adicionais nas quais os Nsps excluídos foram substituídos sequencialmente pelas sequências correspondentes de M41-CK, os cDNAs de substituição representavam M41-CK Nsp4-8, Nsp9-12, Nsp12-14 e finalmente Nsp15-16. Cada cDNA de substituição continha aprox. 500 nucleotídeos na extremidade 5 'correspondentes à sequência 3' mais M41 inserida anteriormente e aprox. 500 nucleotídeos na extremidade 3 'correspondentes à sequência do gene M41 S. Isto permitiu a inserção da sequência de cDNA M41 por recombinação homóloga e adição sequencial da sequência do gene da replicase M41 contígua. Os cDNAs sintéticos contendo as sequências Nsp derivadas de M41 foram adicionados por recombinação homóloga, utilizando o sistema de seleção dominante transitória (IDS) descrito anteriormente do inventor (consulte PCT / GB2010 / 001293). Os cDNAs derivados de M41 contendo a sequência correspondente aos M41 Nsps-10, -14, -15 e -16 continham os aminoácidos modificados nas posições 85, 393, 183 e 209, respectivamente, conforme indicado emFIG. 10.
Um cDNA completo representando o genoma de M41-CK foi gerado no vírus Vaccinia representando as sequências sintéticas. Dois rIBVs, M41-R-6 e M41-R-12, foram resgatados e demonstraram crescer de maneira semelhante à M41-CK (FIG. 1)
Exemplo 2 - Determinando a patogenicidade de vírus M41 resgatados
Os vírus resgatados no Exemplo 1 foram utilizados para infectar pintos livres de patógenos específicos (SPF) de 8 dias de idade por inoculação ocular e nasal para testá-los quanto à patogenicidade, conforme observado por sinais clínicos diariamente 3-7 dias após a infecção e para atividade ciliar dias 4 e 6 pós-infecção. A perda de atividade ciliar é um método bem estabelecido para determinar a patogenicidade do IBV. Os dois vírus M41-R foram considerados apatogênicos quando comparados ao M41-CK, embora mostrassem alguns sinais clínicos em comparação com os pintos de controle não infectados (FIG. 2) e alguma perda, mas inconsistente, da atividade ciliar (FIG. 3)
Assim, os clones moleculares M41-R de M41-CK não eram patogênicos quando comparados ao vírus parental M41-CK.
Os inventores identificaram várias diferenças de nucleotídeos no M41-R em comparação com as sequências M41-CK. A maioria destes eram mutações sinônimas, pois a alteração nucleotídica não afetou a sequência de aminoácidos da proteína associada à sequência. No entanto, quatro mutações não-sinônimas foram identificadas no gene da replicase de IBV específico para os componentes Nsp-10, Nsp-14, Nsp-15 e Nsp-16 do gene da replicase, essas mutações resultaram em alterações de aminoácidos (Tabela 3).
TABELA 3 Mutações não sinônimas identificadas nos Nsps de M41-R genoma completo Região de Nucleotídeo Nucleotídeo Replicase posição Mutação Alteração de aminoácidos Nsp10 12137 C → T Pro → Leu Nsp14 18114 G → C Val → Leu Nsp15 19047 T → A Leu → Ile Nsp16 20139 G → A Val → Ile
Para determinar se as mutações identificadas foram responsáveis pela perda de patogenicidade associada ao M41-R, a mutação Nsp10 foi reparada e as mutações nas Nsp-14, -15 e -16 foram reparadas e demonstraram crescer de maneira semelhante à M41-CK (FIG. 9) Os inventores assim geraram os rIBVs, M41R-nsp10rep e M41R-nsp14, 15, 16rep, usando cDNAs sintéticos contendo os nucleotídeos corretos utilizando o sistema descrito anteriormente (TDS) do inventor (consulte PCT / GB2010 / 001293).
Os rIBVs foram avaliados quanto à patogenicidade em pintos, como descrito anteriormente. Ambos os rIBVs apresentaram patogenicidade aumentada quando comparados ao M41-R, mas não ao nível observado com o M41-CK (As figs. 4 e 5) M41R-nsp14, 15, 16rep deu mais sinais clínicos e mais redução na atividade ciliar que M41R-nsp10rep. No geral, esses resultados indicaram que as alterações associadas aos quatro Nsps parecem afetar a patogenicidade.
Para determinar os papéis dos Nsps na patogenicidade, o cDNA completo correspondente a M41R-nsp10rep foi usado para reparar as mutações em Nsps14, 15 e 16 usando um cDNA sintético contendo os nucleotídeos corretos que utilizam o sistema TDS.
Os seguintes rIBVs foram produzidos:
M41R-nsp10, 15rep - M41-R com as mutações no Nsp-10 e Nsp-15 reparadas
M41R-nsp10, 14, 15rep - M41-R com mutações nos Nsp-10, -14 e -15 reparados
M41R-nsp10, 14, 16rep - M41-R com mutações nos Nsp-10, -14 e -16 reparados
M41R-nsp10, 15, 16rep - M41-R com mutações nos Nsp-10, -15 e -16 reparados
M41-K - todas as quatro mutações, Nsp-10, -14, -15 e -16 reparadas em M41-R
Os rIBVs demonstraram crescer de maneira semelhante à M41-CK (FIG. 9) e avaliados quanto à patogenicidade, conforme descrito anteriormente. M41-K (em que todas as quatro mutações foram reparadas) resultou em sinais clínicos e perda de 100% da atividade ciliar (ciliostose completa) por 4 dias após a infecção (As figs. 6, 7 e 8) Os outros rIBVs demonstraram níveis variados de patogenicidade, além de M41R-nsp10, 15, 16rep, que era essencialmente apatogênico. Esses resultados confirmaram que o reparo de todos os quatro Nsps restaurou a patogenicidade do M41-R; novamente apoiando a evidência anterior de que as mutações descritas nos quatro Nsps estão implicadas na atenuação de M41-CK.
Os inventores também geraram rIBV M41R-nsp 10, 14 rep (nsp 10 e 14 são reparados, nsp 15 e 16 contêm mutações) e rIBV M41R-nsp 10, 16 rep (nsp 10 e 16 são reparados, nsp 14 e 15 contêm mutações ) e avaliou a patogenicidade desses vírus.
O rIBV M41R-nsp 10, 14 rep é menos patogênico que o M41-K, mas causou cerca de 50% de ciliostase nos dias 4-6 após a infecção. O rIBV M41R-nsp 10, 16 rep foi quase apatogênico e não causou ciliostose (consulteFIG. 11 a - c )
Assim, o genoma associado ao M41-R é um potencial genoma da coluna vertebral para um IBV racionalmente atenuado.
Exemplo 4 - Estudo de vacinação / desafio com M41-R
Os vírus candidatos à vacina foram testados em estudos nos quais os ovos de galinha fertilizados foram vacinados no ovo aos 18 dias de embrionação e nos quais foi determinada a eclodibilidade dos ovos inoculados. A saúde clínica das galinhas foi investigada e as galinhas foram desafiadas aos 21 dias de idade com um vírus virulento de desafio IB M41 a 10 3,65 EID 50 por dose.
Os sinais clínicos foram investigados após a proteção por desafio pela vacina e um teste de ciliostase foi realizado 5 dias após o desafio para investigar o efeito dos vírus de desafio no movimento dos cílios e a proteção pela vacina contra a ciliostasis (inibição do movimento dos cílios).
Vacinação Ovo em Ovos de Frango Comercial
O desenho da experiência é apresentado na Tabela 4 e os resultados clínicos são apresentados na Tabela 5. A eclodibilidade dos ovos inoculados com IB M41-R foi boa e as galinhas estavam saudáveis. IB M41-R protegido contra sinais clínicos após desafio nos frangos de corte (placebo: 19/19 afetado, 1B M41-R: 3/18 afetado e 1 morto). Os resultados do teste de ciliostase são apresentados na Tabela 6. O IB M41-R gerou proteção contra a ciliostase.
TABELA 4 Desenho de um estudo de eclodibilidade, segurança e eficácia em ovos comerciais EID 50 1 Rota Dias) Dias) Fim Nr. do Tratamento por do do do do ovos por Tratamento Descrição dose Admin Admin Desafio 2 Estude tratamento T01 Nenhum N / D N / D N / D N / D N / D 30 T02 IB M41-R 10 4 In ovo 18 dias Aos 21 dias Aos 26 anos 30 NTX Salina N / D In ovo embrião- de 20 anos dias 30 nação galinhas de idade por grupo 1 Volume da dose 0,1 ml, NA, não aplicável. 2 10 3,65 EID 50 por dose.
TABELA 5 Porcentagens de hachura e dados clínicos antes e depois desafio em galinhas comerciais, para o projeto, veja a Tabela 1. Antes Depois de desafio desafio Escotilha/ Vital/ Mortes / Sintomas / Mortes / Sintomas / Tratamento total total total total total total Nenhum 28/30 Eutanásia diretamente após a eclosão para coleta de sangue IB M41-R 28/30 28/28 1/20 0/19 1/19 3/18 1, 7 Salina 29/30 29/29 1/20 0/19 0/19 19/19 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 1 Sistema respiratório perturbado 2 Whizzing 3 Mudança de voz 4 Respiração difícil 5 seios intra-orbitais inchados 6 Crescimento desigual 7 Fraco
TABELA 6 Resultados do teste de ciliostase após desafio, para o projeto, consulte a Tabela 1. Tratamento Protegido / total Proteção percentual Salina 0/19 0% IB M41R 18/5 28%
Na vacinação Ovo em ovos sem patógenos específicos (SPF)
O desenho do estudo em ovos SPF é apresentado na Tabela 7 e é semelhante ao desenho dos estudos com frangos de corte comerciais, mas a dose de vacinação para 1B M41-R foi maior (10 5 EID 50 por dose).
Os resultados (Tabela 8) mostram que a porcentagem de eclosão da escotilha IB M41-R foi baixa e 19 de 40 eclodiram e os filhotes foram fracos. Oito filhotes morreram. As 11 galinhas restantes foram desafiadas e 11 das crias nascidas dos ovos que foram inoculados com solução salina foram desafiadas.
No teste de ciliostase após desafio, parecia que todas as galinhas vacinadas no ovo com IB M41-R estavam protegidas, enquanto nenhum dos controles estava protegido, veja a Tabela 9.
TABELA 7 Desenho de um estudo de eclodibilidade, segurança e eficácia em ovos com FPS EID 50 1 Rota Dia Dia Fim Nr. do Tratamento por do do do do ovos por Tratamento Descrição dose Admin Admin Desafio 2 Estude tratamento T01 IB M41-R 10 5 In ovo 18 dias Aos 21 dias Aos 26 anos 40. embrião- de idade dias T04 Salina N / D In ovo nação de idade 40. NTX N / D N / D N / D N / D 10 1 Volume da dose 0,1 ml, NA, não aplicável. 2 Dose de desafio 10 3,3 EID 50 em 0,2 ml.
TABELA 8 Porcentagens de hachura e dados clínicos antes e depois desafio em frangos SPF, para o projeto, consulte a Tabela 7. Antes Depois de desafio desafio Escotilha/ Vital/ Mortes / Sintomas / Mortes / Sintomas / Tratamento total total total total total total IB M41-R 19/40 11/40 8/40 fraco 0 0 0 0 Salina 30/40 30/40 0 0 - 0 0 0 0 N / D 9/10 9/10 0 0 - - -
TABELA 9 Resultados do teste de ciliostase após desafio, para o projeto, consulte a Tabela 7. Tratamento Protegido / total Proteção percentual Salina 0/11 0% IB M41R 11/11 100%
Em conclusão, o IB M41-R foi seguro em ovos comerciais, gerou proteção contra sinais clínicos e, em certa medida, contra ciliostose.
Nos ovos com FPS vacinados com IB M41 R, um número relativamente baixo de galinhas chocou. Isto pode dever-se aos 10 5 EID 50 por ovo de 1B M41-R usado. Isso foi 10 vezes maior que a dose usada em estudos anteriores, nos quais houve um nível mais alto de eclodibilidade. As porcentagens mais baixas de eclosão também podem ser causadas por uma suscetibilidade particularmente alta do lote de óvulos SPF a vírus, pois em outros estudos o nível de mortalidade embrionária também foi maior que o observado anteriormente.
Após o desafio, todas as galinhas sobreviventes após a eclosão foram completamente protegidas contra a ciliostose. Conclui-se que o IB M41-R possui grande potencial como vacina a ser administrada in ovo.
Todas as publicações mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica, sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para os especialistas em biologia molecular, virologia ou campos relacionados, devem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.
Reivindicações (25)
Ocultar dependente
Reivindicações (25)
Ocultar dependente
A invenção reivindicada é:
1. Coronavírus vivo atenuado que compreende um gene da replicase variante que codifica poliproteínas que compreende uma mutação em uma ou ambas as proteínas não estruturais nsp-10 e nsp-14, em que o gene da replicase variante codifica uma proteína que compreende uma mutação de aminoácidos de Pro para Leu na posição correspondente à posição 85 da SEQ ID NO: 6, e / ou em que o gene da replicase variante codifica uma proteína que compreende uma mutação de aminoácido de Val para Leu na posição correspondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7)
2. O coronavírus de acordo com reivindicação 1 em que o gene da replicase variante codifica uma proteína que compreende uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir de:
uma mutação de aminoácido de Leu para lie na posição correspondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e
uma mutação de aminoácido de Val para Ile na posição correspondente à posição 209 da SEQ ID NO: 9.
3. O coronavírus de acordo com reivindicação 1em que o gene da replicase codifica uma proteína compreendendo as mutações de aminoácidos Val a Leu na posição correspondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu a lie na posição correspondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val a Ile na posição correspondente à posição 209 da SEQ ID NO: 9.
4. O coronavírus de acordo com reivindicação 1em que o gene da replicase codifica uma proteína compreendendo as mutações de aminoácidos Pro a Leu na posição correspondente à posição 85 da SEQ ID NO: 6; Val a Leu na posição correspondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu a lie na posição correspondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val a Ile na posição correspondente à posição 209 da SEQ ID NO: 9.
5. O coronavírus de acordo com reivindicação 1 em que o gene da replicase compreende pelo menos uma substituição de nucleotídeo selecionada dentre:
Posição de nucleótido C a Tat 12137; e
G a C na posição nucleotídica 18114;
comparado com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1;
e opcionalmente, compreende uma ou mais substituições nucleotídicas selecionadas de T a A na posição nucleotídica 19047; e
G a A na posição nucleotídica 20139;
comparado com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1.
6. O coronavírus de acordo com reivindicação 1 que é um vírus da bronquite infecciosa (IBV).
7. O coronavírus de acordo com reivindicação 1 que é o IBV M41.
8. O coronavírus de acordo com reivindicação 7, que compreende pelo menos uma proteína S, parte do qual é de um sorotipo de IBV diferente de M41.
9. O coronavírus de acordo com reivindicação 8, em que a subunidade S1 é de um sorotipo IBV diferente de M41.
10. O coronavírus de acordo com reivindicação 8, em que a proteína S é de um sorotipo de IBV diferente de M41.
11. O coronavírus de acordo com reivindicação 1 que reduziu a patogenicidade em comparação com um coronavírus que expressa uma replicase de tipo selvagem correspondente, em que o vírus é capaz de se replicar sem ser patogênico para o embrião quando administrado a um ovo embrionado.
12. Um gene variante da replicase, conforme definido em reivindicação 1.
13. Proteína codificada por um gene variante da coronavírus replicase, de acordo com reivindicação 12.
14. Um plasmídeo compreendendo um gene de replicase de acordo com reivindicação 12.
15. Um método para produzir o coronavírus de acordo com reivindicação 1 que compreende as seguintes etapas:
(i) transfectar um plasmídeo de acordo com reivindicação 14 em uma célula hospedeira;
(ii) infectar a célula hospedeira com um vírus recombinante compreendendo o genoma de uma cepa de coronavírus com um gene de replicase;
(iii) permitir que ocorra recombinação homóloga entre as sequências do gene da replicase no plasmídeo e as sequências correspondentes no genoma do vírus recombinante para produzir um gene da replicase modificado; e
(iv) seleção de vírus recombinantes compreendendo o gene da replicase modificado.
16. O método de acordo com reivindicação 15, em que o vírus recombinante é um vírus vaccinia.
17. O método de acordo com reivindicação 15 que também inclui a etapa:
(v) recuperação de coronavírus recombinante compreendendo o gene da replicase modificada do DNA do vírus recombinante da etapa (iv).
18. Uma célula capaz de produzir um coronavírus de acordo com reivindicação 1.
19. Uma vacina compreendendo um coronavírus de acordo com reivindicação 1 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
20. Método para tratamento e / ou prevenção de uma doença em um sujeito que compreende a etapa de administrar uma vacina de acordo com reivindicação 19 para o assunto.
21. O método de reivindicação 20, em que a doença é bronquite infecciosa (IB).
22. O método de acordo com reivindicação 20em que o método de administração é selecionado do grupo que consiste em; administração de colírio, administração intranasal, administração de água potável, injeção pós-eclosão e injeção in ovo.
23. O método de acordo com reivindicação 21 em que a administração é vacinação in ovo.
24. Um método para produzir uma vacina de acordo com reivindicação 19, que compreende a etapa de infectar uma célula de acordo com reivindicação 18 com um coronavírus de acordo com reivindicação 1.
25. O coronavírus de acordo com reivindicação 1, compreendendo ainda uma mutação em um ou ambos dos nsp-15 e nsp-16.
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